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          北京實驗室 武漢實驗室 楊凌實驗室
          測序過程中常見的峰圖及原因分析
          2011/09/01, 瀏覽

          常見問題峰圖

          1、PCR產物測序時出現重疊峰

          問題圖1(模板中有堿基缺失,往往是單一位點(1-1)或兩個位點(1-2)堿基缺失導致測序結果移碼)

          解決方法:將PCR產物克隆到質粒(如T載體)中挑單克隆測序,或將PCR產物進行PAGE純化(至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化)后再進行測序。

          問題圖2(PCR產物不純,含部分序列一致的兩種以上的片段,長度不一)

          解決方法:主要原因是PCR產物沒有純化,含有部分序列一致的兩種以上長度不一的片段,將PCR產物進行PAGE純化(至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化)后再進行測序,便可解決。

          問題圖3(測序引物有堿基缺失)

          測序引物有堿基缺失(一般是引物的5'端缺失),和模板的堿基缺失即圖1有些類似,所不同的是模板堿基缺失一般是在一段正常測序序列后才出現移碼,而引物堿基缺失的話,則從測序一開始就出現移碼,表面在圖形上便是一開始就是嚴重的峰形重疊。

          解決方法:重新合成引物,或將引物進行PAGE純化

          2、克隆測序時出現峰形重疊

          原因:所挑選的重組子不是單克隆,所提供的測序用質粒中含有兩種以上插入片段不同的質粒;或是是送測序的菌液污染

          解決方法:重新挑單克隆的菌落(劃線分離單菌落),提質?;蛩途涸俅螠y序。

          3、樣品有雜合/突變位點

          模板中有雜合型突變,也就說模板本身在這個位點出現突變;或者是從基因組中擴增出來的雜合位點。如果模板有雜合(突變或缺失),那么測序圖形中其他的位點一般都是單一的峰形,然后突然在某一個位點出現重疊峰(如圖中箭頭所示)。

          解決方法:建議將DNA片段克隆到載體再測序。

          4、polyA/T和C/Gcluster導致的套峰和測序信號衰減

          RACE測序時經常遇到圖4-1和圖4-4的情形,解決方法:從另一端測序;或者構建載體進行測序。

          5、基因中含有重復序列

          可能的原因:樣品中含有重復序列導致的測序結果和PolyA/T的結果一樣,會導致Frame滑動,較短的重復序列會導致測序結果出現移碼;而較長的重復序列會使定序信號衰減。

          解決辦法:反向測序有時能夠順利的通過重復序列區域(但不是一定都能夠),通過多次的測序結果比對,拼接可以得到全序列結果。

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