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          北京實驗室 武漢實驗室 楊凌實驗室
          引物設計原則
          2011/08/19, 瀏覽

          1.引物最好在模板cDNA的保守區內設計。
          DNA
          序列的保守區是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因,通過序列分析軟件(比如DNAman)比對(Alignment),各基因相同的序列就是該基因的保守區。

          2.
          引物長度一般在15~30堿基之間。
          引物長度(primer length)常用的是18-27 bp,但不應大于38,因為過長會導致其延伸溫度大于74,不適于Taq DNA 聚合酶進行反應。

          3.
          引物GC含量在40%~60%之間,Tm值最好接近72。
          GC
          含量(composition)過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(melting temperature)是寡核苷酸的解鏈溫度,即在一定鹽濃度條件下,50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度,一般高于Tm5~10。若按公式Tm= 4G+C+2A+T)估計引物的Tm值,則有效引物的Tm55~80,其Tm值最好接近72以使復性條件最佳。

          4.
          引物3′端不能選擇A,最好選擇T。
          引物3′端錯配時,不同堿基引發效率存在著很大的差異,當末位的堿基為A時,即使在錯配的情況下,也能有引發鏈的合成,而當末位鏈為T時,錯配的引發效率大大降低,G、C錯配的引發效率介于A、T之間,所以3′端最好選擇T。

          5.
          堿基要隨機分布。
          引物序列在模板內應當沒有相似性較高,尤其是3’端相似性較高的序列,否則容易導致錯誤引發(False priming)。降低引物與模板相似性的一種方法是,引物中四種堿基的分布最好是隨機的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的GC,因這樣會使引物在GC富集序列區錯誤引發。

          6.
          引物自身及引物之間不應存在互補序列。
          引物自身不應存在互補序列,否則引物自身會折疊成發夾結構(Hairpin)使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續4個堿基的互補。
          兩引物之間也不應具有互補性,尤其應避免3′ 端的互補重疊以防止引物二聚體(DimerCross dimer)的形成。引物之間不能有連續4個堿基的互補。

          引物二聚體及發夾結構如果不可避免的話,應盡量使其
          G值不要過高(應小于4.5kcal/mol)。否則易導致產生引物二聚體帶,并且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行。

          7.
          引物5′ 端和中間
          G值應該相對較高,而3′ G值較低。

          G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能,它反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性,G值越大,則雙鏈越穩定。應當選用5′ 端和中間G值相對較高,而3′ G值較低(絕對值不超過9)的引物。引物3′ 端的G 值過高,容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA 聚合反應。(不同位置的G值可以用Oligo 6軟件進行分析)

          8.
          引物的5′端可以修飾,而3′端不可修飾。
          引物的5′ 端決定著PCR產物的長度,它對擴增特異性影響不大。因此,可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′ 端修飾包括:加酶切位點;標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白質結合DNA序列;引入點突變、插入突變、缺失突變序列;引入啟動子序列等。

          引物的延伸是從3′ 端開始的,不能進行任何修飾。3′ 端也不能有形成任何二級結構可能。

          9.
          引物應具有特異性。
          引物設計完成以后,應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性,就可以進行下一步的實驗了。

          值得一提的是,各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難,例如GC含量偏高或偏低,導致找不到各種指標都十分合適的引物;用作克隆目的的PCR,因為產物序列相對固定,引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次,盡量去滿足條件。做Real Time,用于SYBR Green I法時的一對引物與一般PCR的引物,在引物設計上所要求的參數是不同的。引物設計的要求:

          1)
          避免重復堿基,尤其是
          G.
          2)Tm=58-60
          度。

          3
          GC=30-80%.
          4)3'
          端最后5個堿基內不能有多于2個的G
          C.
          5)
          正向引物與探針離得越近越好,但不能重疊。

          6)PCR
          擴增產物長度: 引物的產物大小不要太大,一般在80-250bp之間都可;80150 bp最為合適(可以延長至300 bp)。

          7)
          引物的退火溫度要高,一般要在60度以上;

          要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。

          而且引物設計時應該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力,即引物應該跨外顯子,最好是引物能跨外顯子的接頭區,這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。

           

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