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          北京實驗室 武漢實驗室 楊凌實驗室
          合成中常見的問題解答
          2011/08/19, 瀏覽

          1. oligo的形態應該是什么樣的?

          答:如無特殊聲明,本公司出品的寡核苷酸(oligo)均以凍干粉形式提供,因為影響結晶形態的因素較多,產品外觀形態、顏色會有差異,有些無肉眼可見的形態,也為正?,F象。

          2. oligo如何進行稀釋?

          答:由于靜電或氣流的沖擊,微小的寡核苷酸凍干粉在開蓋時有可能飛出管外,因此在您稀釋之前請短暫離心(3000轉、1分鐘即可)之后再開蓋復溶。

          我們會在您的合成報告單上為您提供每管引物溶解為100 uM所需的溶劑ul數,如果您需要稀釋到特殊濃度,請參照以下表格進行快速計算:

          溶解濃度

          10 uM

          50 uM

          200 uM

          加水量

          =nmol*100

          =nmol*20

          =nmol*5

          3. oligo的保存條件及存放時間分別是什么?

          答:(1)Oligo DNA干燥制品很穩定,常溫下可保存數月,但最好置于-20℃保存。(2)溶解后的DNA溶液可于4℃短期保存,長期保存請置于-20℃。在溶解和使用DNA溶液時,請避免核酸酶污染,減少DNA溶液的反復凍融。(3)熒光標記Oligo DNA對光敏感,在日光下熒光強度會降低。為了保持熒光標記Oligo DNA 的熒光效率,請于-20℃避光保存。 Cy3與Cy5在溶液pH>9的條件下會發生分解,所以稀釋Cy3與Cy5標記的Oligo DNA 時請注意溶液的pH值。

          4. oligo可以用瓊脂糖凝膠電泳染色嗎?

          答:不可以。EB染色主要是通過嵌入到DNA 雙鏈的堿基之間來進行染色的。而普通合成的oligo為單鏈,不適合進行EB染色。如果您想要觀察引物條帶,請使用15%的變性PAGE膠,7M Urea*TBE Buffer,50% Formamide上樣電泳,置于硅膠熒光板上,在紫外燈下觀察。

          5. 合成的oligo5’端是否帶磷酸基團?

          答:如果無特殊修飾,常規化學合成的寡核苷酸的5`及3`端均為羥基,合成短adaptor等直接用于連接時請充分考慮此點,如有必要,請選擇磷酸化等基團修飾。

          6. 常見的簡并堿基代碼是什么?

          答:M=(A/C),W=(A/T),H=(A/T/C),V=(G/ A/C),D=(G/A/T),Y=(C/T),K=(G/T), S=(G/C),B=(G/T/C),N=(A/G/C/T),R=(A/G)。

          7. 長鏈合成的純度大概有多少?

          答:Oligo的化學合成是堿基與堿基之間通過化學反應偶聯而成,而化學反應的偶聯效率一般在99%左右,也就是說,在每次進行偶聯反應時,都會有1%的片段附加不上新的堿基,對這種截斷的失敗序列,為了防止其參與后續的偶聯反應,采用Cap溶液進行化學封閉,以阻斷其延伸,但化學封閉反應的效率不可能達到100%。因此引物序列越長會導致其濃度越低,對于長序列引物,我們建議客戶在測序時多選擇幾個克隆進行試驗,以減少錯誤。

          8. 如何制備雙鏈DNA?

          答:1)配制STE溶液:即10mM Tris, 1 mM EDTA, 100mM NaCl 其中,一定濃度的鹽離子是比較關鍵的一個因素;

          2)根據OD值和分子量,計算摩爾數;按1 OD = 33 ug 計

          3)溶解摩爾數大的一條鏈至適當體積,一般50 ~100 ul;更高濃度的寡核苷酸會有助于退火完全;

          4)取一定體積(與互補配對的另一條鏈等摩爾數)已溶解的寡核苷酸加入到互補鏈

          5)95℃ 3分鐘變性,用PCR儀或水浴加熱,然后自然冷卻至室溫即可(最好放置于一定體積的水浴中與水同時冷卻,以確保退火完全,避免降溫過快)。

          9. 擴增無條帶需要考慮哪些方面的原因?

          答:1)設計的引物與模板不匹配,引物擴增效率低

          2)所用試劑包括cDNA、酶、buffer、dNTP、水等是否出現污染或降解;

          3)反應體系是否需要優化;

          4)選用的退火溫度以及試驗條件是否需要優化;

          擴增無條帶的原因可能有很多,如果您排除了試驗的原因后,我們可以為您提供免費重合。由于考慮到引物存放等的問題,合成引物的投訴受理期限為三個月,超過三個月恕不受理。

          10.出現非特異性擴增主要是什么原因?

          答:1)引物設計是否恰當。

          2)引物特異性差。

          3)模板或引物濃度過高。

          4)酶量過多。

          5)Mg2+濃度偏高:DNA聚合酶的催化活性對Mg2+濃度非常敏感,其濃度在2.0mmol/L時該酶催化活性最高,此濃度能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性,Mg2+過高就抑制酶活性,由于Mg2+能與dNTP結合而影響PCR反應液中游離的Mg2+濃度,因而Mgcl2的濃度在不同的反應體系中應適當調整,優化濃度。一般反應中Mg2+濃度至少應比dNTP總濃度高0.5~1.0mmol/L。

          6)退火溫度偏低

          7)循環次數過多

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